基因編輯工具開發(fā)及安全性評價
CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)自問世以來具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，然而其介導(dǎo)的DNA 雙鏈斷裂（DSB）會造成嚴(yán)重的脫靶問題，存在巨大的安全隱患。單堿基編輯工具自2016 年出現(xiàn)以來，具備精確和高效的編輯效率而且無需造成DNA 雙鏈斷裂，被視為比CRISPR-Cas9 技術(shù)更安全的基因編輯工具。然而由于基因編輯脫靶檢測技術(shù)的局限性，各種基因編輯工具的脫靶風(fēng)險一直備受關(guān)注。近年來，科研人員推出過多種檢測脫靶的方案，這些方案或者依賴于計算機軟件預(yù)測，或者依賴于高通量測序檢測DSB 產(chǎn)生，還有體外檢測的方案。這些方案都存在一定的局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此關(guān)于CRISPR-Cas9 及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。科學(xué)家們希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點預(yù)測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。本實驗室開發(fā)的GOTI 的檢測技術(shù)完全滿足了上述兩點，并使用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BE3 存在非常嚴(yán)重的脫靶，而且這些脫靶大多出現(xiàn)在傳統(tǒng)脫靶預(yù)測認(rèn)為不太可能出現(xiàn)的位點，因此之前方法一直沒有發(fā)現(xiàn)其脫靶問題。這一發(fā)現(xiàn)也讓世人重新審視了這些新興技術(shù)的風(fēng)險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準(zhǔn)確性上遠(yuǎn)超越之前的基因編輯脫靶檢測技術(shù)，有望由此開發(fā)精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業(yè)的新標(biāo)準(zhǔn)。同時，我們通過全轉(zhuǎn)錄組RNA測序發(fā)現(xiàn)DNA編輯工具單堿基編輯技術(shù)存在大量的RNA脫靶，首次證明了BE3、BE3-hA3A和ABE7.10等多個單堿基編輯技術(shù)均存在大量的RNA脫靶，并且ABE7.10還會導(dǎo)致大量的癌基因和抑癌基因突變，具有較強的致癌風(fēng)險。該研究進而通過點突變的方式對三種單堿基編輯工具進行突變優(yōu)化，使其完全消除RNA脫靶的活性，首次獲得三種更高精度的單堿基編輯工具，為單堿基編輯基礎(chǔ)進入臨床治療提供了重要的基礎(chǔ)。
利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建動物模型
CRISPR-Cas9系統(tǒng)是一種非常高效的基因編輯方法，但是大部分被基因編輯過的動物都有嵌合性，也就是說它們只有一部分細(xì)胞的基因發(fā)生了編輯。對于涉及表型的研究而言，嵌合的基因編輯動物需要進一步地雜交育種，才能得到完全的基因敲除動物。本實驗室開發(fā)的簡稱C-CRISPR（Cocktail CRISPR）技術(shù)能同時產(chǎn)生插入缺失和外顯子刪除，從而實現(xiàn)高效的基因完全敲除，并且獲得了F0代Prrt2基因功能完全敲除的具有陣發(fā)性運動障礙表型的食蟹猴模型。將C-CRISPR與單堿基編輯系統(tǒng)結(jié)合，通過對基因編輯引入多個終止密碼子的方式，成功實現(xiàn)F0代小鼠多個功能基因-完全敲除。C-CRISPR及單堿基編輯方法可以高通量制作各種基因完全敲除小鼠用于表型分析，并快速制作基因敲除小動物、大動物模型。
推動基因編輯應(yīng)用于成體疾病治療
在臨床治療應(yīng)用方面，精確的靶向基因組編輯至關(guān)重要。目前我們有但不限于以下方法應(yīng)用于疾病治療，以HMEJ為基礎(chǔ)的靶向整合策略、單堿基編輯技術(shù)、SPH激活系統(tǒng)。常用的同源重組（HR）策略介導(dǎo)的基因靶向整合在動物胚胎和組織中效率低下。我們設(shè)計了一種新的以HMEJ 為基礎(chǔ)的靶向精確整合策略，其效率遠(yuǎn)高于以HR為基礎(chǔ)的策略。使用該策略，我們成功的治療了Fah 基因突變的肝損傷模型小鼠。HMEJ 介導(dǎo)的基因敲入方法擁有更高效的編輯效率和更好的精確度，為疾病的大片段靶向基因治療等應(yīng)用提供了非常大的前景。同時，我們擬使用改造后無脫靶效應(yīng)的的單堿基編輯系統(tǒng)應(yīng)用于單堿基突變的疾病治療。單堿基編輯系統(tǒng)可以不造成DNA雙鏈斷裂情況下就定向修復(fù)單堿基突變，在原理上更加安全與高效。除此之外，我們開發(fā)出一種比以往更加強大的激活系統(tǒng)（SPH），在人和小鼠的細(xì)胞上分別驗證了SPH系統(tǒng)的高效性。同時，體內(nèi)實驗也證明了可以利用SPH小鼠在腦內(nèi)實現(xiàn)復(fù)雜基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。該體內(nèi)激活系統(tǒng)的建立，不僅為在腦內(nèi)研究復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)以及獲得性的表型提供重要的技術(shù)手段，而且為將來進一步治療表觀遺傳疾病提供了理論基礎(chǔ)。
研究組組長;高級研究員
