發(fā)布時(shí)間：2023-12-12
2023年12月11日,《Development》雜志在線(xiàn)發(fā)表了題為《In situ regeneration of inner hair cells in the damaged cochlea by temporally regulated coexpression of Atoh1 and Tbx2》的研究論文。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉志勇研究組完成。研究團隊構建了耳蝸內毛細胞特異性損傷的小鼠模型，并在該模型的基礎上把幼年耳蝸支持細胞轉分化為新的內毛細胞，從而實(shí)現了損傷耳蝸內源性?xún)让毎蟮脑辉偕?/font>，并對新的內毛細胞進(jìn)行了全面詳細的轉錄組學(xué)，形態(tài)學(xué)和電生理特性等分析。
耳蝸是聽(tīng)覺(jué)系統的第一級聲音感受器，其內部的柯蒂氏器官有序排列著(zhù)三排外毛細胞、一排內毛細胞及不同類(lèi)型的支持細胞。內毛細胞負責將聲波轉換為電信號，并傳遞給螺旋神經(jīng)節（聽(tīng)神經(jīng)）。與非哺乳類(lèi)動(dòng)物（如魚(yú)類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi)）不同，哺乳類(lèi)動(dòng)物喪失了再生毛細胞的能力，因此毛細胞一旦損壞將導致不可逆的永久性耳聾。IBCs/IPhs是耳蝸支持細胞的兩種亞型，它們與內毛細胞在空間位置上彼此相鄰，并且在發(fā)育過(guò)程中具有相似的細胞起源。因此，IBCs/IPhs是內毛細胞再生的潛在細胞來(lái)源和基因操縱靶點(diǎn)(圖1A)。本實(shí)驗室前期通過(guò)在新生小鼠耳蝸IBCs/IPhs中條件性地異位過(guò)表達Atoh1和Tbx2，在正常（沒(méi)有損傷）耳蝸內成功地將IBCs/IPhs轉分化為vGlut3+新生內毛細胞。但仍有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題亟待解決：1）在內毛細胞損傷的耳蝸內，能否再生出新的內毛細胞？2）新的內毛細胞與野生型內毛細胞在轉錄組水平和電生理特性方面的相似度如何？3）新的內毛細胞能否實(shí)現聽(tīng)力的恢復或者部分恢復？
為解決以上科學(xué)問(wèn)題，研究人員首先構建了內毛細胞特異性損傷的小鼠模型Fgf8-DTR/+小鼠模型。當Fgf8-DTR/+ 被注射白喉毒素（DT）后，可以導致97.8%的內毛細胞死亡。為了探究損傷野生型內毛細胞能否增加支持細胞轉分化為內毛細胞的效率，研究人員構建了一個(gè)能夠進(jìn)行精細調控基因表達的小鼠模型，Plp1-CreER+;Rosa26-Loxp-stop-Loxp-Tbx2-P2A-DHFR*Atoh1*DHFR-T2A-tdTomato/+; Fgf8-DTR/+ (簡(jiǎn)稱(chēng)Plp1-TAT-DTR)，并分為兩組: 1)第一組作為對照組，僅在P2注射DT (圖1B-B”和圖2A-A’); 2)第二組在P0和P1注射他莫西芬 (TMX)﹑P2注射DT，P3和P4注射甲氧芐啶 (TMP, 用于結合DHFR，從而瞬時(shí)穩定Atoh1的表達)，被定義為TMX/DT/TMP實(shí)驗組(圖1C-C”和圖2B-B’)。實(shí)驗結果顯示，實(shí)驗組有477.0 48.0個(gè)內毛細胞，遠遠高于對照組（17.3 4.0）。并且損傷情況下的新生內毛細胞的再生效率（73.5% 2.3%）顯著(zhù)高于未損傷的再生效率（29.5% 1.2%，圖1D）。更為重要的是，單細胞轉錄組分析（圖1E）和膜片鉗電生理分析（圖1F-G）表明新的內毛細胞和野生型的內毛細胞具有高度的相似度（達60%以上），透射電鏡可觀(guān)察到新的內毛細胞囊泡結構的產(chǎn)生（圖2C-D’）。本研究首次證明了當內源性內毛細胞受損時(shí)，新生IBCs/IPhs中異位表達Atoh1和Tbx2，可以再生出新的內毛細胞，它們在轉錄組和電生理水平上，與內源性?xún)让毎?/font>60%以上的相似度，并且再生效率比沒(méi)有內源性?xún)让毎麚p傷時(shí)有顯著(zhù)提高。
圖1：A.內毛細胞損傷再生的示意圖；B.內毛細胞損傷小鼠模型可以高效特異的損傷內毛細胞；C.在內毛細胞損傷的情況下，異位表達Atoh1與Tbx2可再生出vGlut3+的新生內毛細胞；D.損傷情況下的再生毛細胞效率顯著(zhù)提高；E.轉錄組水平上，新生毛細胞與野生型P30內毛細胞聚為一群；F-G.新生內毛細胞的電壓依賴(lài)的Ca電流與野生型內毛細胞相似。
為了探討再生出的新生內毛細胞是否具有生物學(xué)功能，研究人員通過(guò)聽(tīng)覺(jué)腦干反應檢測并比較了Plp1-Ai9（TMX/TMP，陽(yáng)性對照組）、Plp1-TAT-DTR（DT，陰性對照組）和Plp1-TAT-DTR（TMX/DT/TMP，實(shí)驗組）三者之間的聽(tīng)力，結果顯示實(shí)驗組小鼠的聽(tīng)力未能得到恢復（圖2E）。為了進(jìn)一步尋找聽(tīng)力不能恢復的主要原因，研究人員利用電生理技術(shù)，發(fā)現新的內毛細胞不具備機械敏感電轉導通道電流（圖2F-H）。該發(fā)現解釋了新的內毛細胞無(wú)法感知外界聲音信號，無(wú)法恢復聽(tīng)力的原因，從而為未來(lái)如何再生出有功能的毛細胞提供了方向。
圖2.A-B.掃描電鏡可觀(guān)察到在內源內毛細胞損傷的情況下，新生內毛細胞可再生出新的纖毛結構；C-D.透射電鏡可觀(guān)察到新生內毛細胞有囊泡結構的產(chǎn)生；E.但小鼠聽(tīng)力未能得到有效的改善；F-H.電生理技術(shù)發(fā)現新的內毛細胞不具備機械敏感的MET通道電流。
中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心劉志勇研究員與畢政鴻副研究員為本論文的通訊作者，劉志勇組副研究員李響為本論文的第一作者，博士研究生任旻蕙在生物信息學(xué)分析上做了大量工作，博士研究生顧云鵬和研究助理朱彤為本項目做了重要貢獻，上海交通大學(xué)第九人民醫院張宇博士和腦智卓越中心李杰博士共同完成電生理研究?jì)热?/font>，腦智卓越中心副研究員李超和王廣琴博士也對本項目提供了幫助，上海交通大學(xué)第九人民醫院宋雷教授對本課題電生理內容給予了重要的指導。中國科學(xué)院腦智卓越中心光學(xué)平臺、電鏡平臺、分子細胞技術(shù)平臺和嚙齒類(lèi)實(shí)驗動(dòng)物平臺提供了重要技術(shù)支持。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金委員會(huì )、科技部、上海市科委和中國科學(xué)院的資助。
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