發(fā)布時(shí)間：2023-04-06
2023年4月6日，《Cell Stem Cell》期刊在線(xiàn)發(fā)表了題為《食蟹猴胚胎模型體外培養發(fā)育到原腸胚和引起早期妊娠反應》的研究論文，該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）劉真研究組、非人靈長(cháng)類(lèi)研究平臺孫強研究團隊與清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周帆研究組合作完成。該研究利用胚胎干細胞建立了食蟹猴類(lèi)囊胚誘導系統，體外培養食蟹猴類(lèi)囊胚可誘導原腸運動(dòng)的相關(guān)胚層，體內移植可以檢測到早期妊娠囊的出現。
胚胎著(zhù)床至原腸運動(dòng)是發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，也是臨床上早期流產(chǎn)的高發(fā)期。相較于嚙齒類(lèi)模式動(dòng)物，靈長(cháng)類(lèi)著(zhù)床至原腸運動(dòng)時(shí)期的研究嚴重滯后?；谂咛ジ杉毎M裝的類(lèi)胚胎研究為靈長(cháng)類(lèi)早期著(zhù)床發(fā)育提供了新的途徑。目前小鼠胚胎干細胞來(lái)源的類(lèi)胚胎能體外培養到神經(jīng)發(fā)生和器官發(fā)生階段，人胚胎干細胞誘導獲得的類(lèi)囊胚也可以模擬囊胚階段的形態(tài)和分子特征。
非人靈長(cháng)類(lèi)擁有與人更為相近的生殖發(fā)育和胚胎發(fā)育特點(diǎn)，是研究人類(lèi)生殖和胚胎發(fā)育的理想動(dòng)物模型。研究團隊創(chuàng )新性地用非人靈長(cháng)類(lèi)胚胎干細胞代替人多能干細胞，進(jìn)行食蟹猴類(lèi)囊胚體外誘導。研究人員通過(guò)比較不同培養狀態(tài)的食蟹猴胚胎干細胞以及優(yōu)化體外誘導體系和方法，高效得到了形態(tài)上和食蟹猴囊胚非常接近的類(lèi)囊胚。結合單細胞轉錄組測序與分析、三個(gè)譜系干細胞體外分離培養，以及其他一系列分子細胞實(shí)驗證明食蟹猴類(lèi)囊胚在主要細胞譜系組成以及相應的轉錄組水平等和正常囊胚相似（圖1A-B）。為了研究其體外發(fā)育潛能，研究人員對食蟹猴類(lèi)囊胚進(jìn)行了長(cháng)時(shí)程體外延遲培養。
當體外培養至D15，類(lèi)囊胚發(fā)育至早期著(zhù)床的雙層胚盤(pán)狀結構，包括典型的OCT4+的EPI樣外胚層結構和明顯的羊膜腔以及GATA6+的卵黃囊腔（圖1C）。研究人員進(jìn)一步培養發(fā)現，體外培養至D17，前面出現的雙層胚盤(pán)樣結構的食蟹猴類(lèi)胚胎中會(huì )有一小部分繼續發(fā)育，形成圓盤(pán)樣結構，并包含前后軸、原條，絨毛膜腔等特征性細胞群體，且部分形態(tài)與之前報道的人類(lèi)CS7（E16-19）時(shí)期的體內原腸胚相似（圖1D）。免疫熒光染色結果進(jìn)一步展示了其形態(tài)特征（圖1E）。結合測序數據的挖掘和對比分析，作者發(fā)現D17食蟹猴類(lèi)胚胎具有上胚層細胞（EPI）, 原條細胞（gastrulating cells）, 原始生殖細胞（PGCs）, 羊膜上皮細胞（AME）, 胚外中胚層細胞（EXMC）, 滋養層細胞（TE）, 內臟內胚層/卵黃囊內胚層細胞（VE/YE）等。此外，D17食蟹猴類(lèi)胚胎中還檢測到了原始造血相關(guān)細胞，包括造血內皮細胞 (HECs), 造血內皮祖細胞 (HEPs)以及幼紅細胞(Ery)。這意味著(zhù)D17食蟹猴類(lèi)胚胎已經(jīng)進(jìn)入三胚層分化階段。
研究團隊進(jìn)一步分析鑒定發(fā)現D17食蟹猴類(lèi)胚胎還具有胚胎非神經(jīng)外胚層（NNE）、新生中胚層（NM），晚期中胚層（AM）、定型內胚層（DE）等三胚層類(lèi)似的細胞群體（圖1F）。該研究揭示了D17食蟹猴類(lèi)胚胎無(wú)論從形態(tài)還是細胞譜系組成上都與之前報道的人的CS7（E16-19）時(shí)期的體內原腸胚相似，提示誘導的類(lèi)囊胚具有模擬著(zhù)床后發(fā)育的能力。研究團隊將該發(fā)育潛能的食蟹猴類(lèi)囊胚進(jìn)行同種體內移植，進(jìn)一步檢測其體內發(fā)育潛力。結果顯示，3/8受體在移植后能檢測到明顯的著(zhù)床點(diǎn)和早期妊娠囊的出現，同時(shí)伴隨血清中絨毛膜促性腺激素和孕激素水平的提高（圖2）。
該研究利用胚胎干細胞體外重構了非人靈長(cháng)類(lèi)類(lèi)囊胚，并對其體內外發(fā)育潛能進(jìn)行深入全面的探究和評估，首次將非人靈長(cháng)類(lèi)的類(lèi)囊胚體外培養至著(zhù)床后原腸胚時(shí)期。
中科院腦智卓越中心博士后李杰，清華大學(xué)周帆課題組科研助理朱慶元，中科院腦智卓越中心與西北農林科技大學(xué)聯(lián)合培養博士生曹靜，清華大學(xué)2021級博士生劉瑩、中科院腦智卓越中心非人靈長(cháng)類(lèi)研究平臺實(shí)驗師陸勇為該論文共同第一作者。中科院腦智卓越中心孫怡迪研究員、孫怡寧、黃奕銘、尚申申、卞新顏、李春楊、張連升博士、王燕、聶艷紅、傅吉強博士，清華大學(xué)2021級博士生李倩，中科院廣州健康院Miguel A. Esteban研究員、李文娟博士、Md. Abdul Mazid博士、姜禹、賈雯淇，西北農林科技大學(xué)王曉龍研究員為本研究提供了重要幫助。該研究得到科技部、中科院、上海市、基金委和臨港實(shí)驗室的資助。
圖1.（A）非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴類(lèi)囊胚體外重構。（B）scRNA-seq分析體外重構的非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴類(lèi)囊胚的細胞譜系構成。（C）非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴類(lèi)囊胚體外延遲培養至D15時(shí)形成的雙層胚盤(pán)樣結構。（D）非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴類(lèi)囊胚體外延遲培養至D17時(shí)形成的原腸胚樣結構。（E）非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴D17類(lèi)胚胎的形態(tài)學(xué)染色。OCT4, EPI marker. GATA6, amine marker. T(Brachyury), gastrulation marker. （F）非人靈長(cháng)類(lèi)食蟹猴D17類(lèi)胚胎的單細胞轉錄組分析和發(fā)育路徑分析。
圖2. 非人靈長(cháng)類(lèi)類(lèi)囊胚體外重構和體內外發(fā)育潛能研究模式圖。
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