發(fā)布時(shí)間：2023-03-18
2023年3月18日，《Cell Stem Cell》期刊以封面文章的形式在線(xiàn)發(fā)表了中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng )新中心（神經(jīng)科學(xué)研究所）、神經(jīng)科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗室陳躍軍研究組題為《人神經(jīng)分化過(guò)程中跨時(shí)間段的克隆譜系追蹤》的研究論文，該研究通過(guò)建立能夠跨分化階段高通量譜系示蹤新技術(shù)-SISBAR，解析了人多能干細胞分化為人腹側中后腦神經(jīng)細胞的單細胞譜系，發(fā)現了許多新的譜系分化路徑和分子調控機制，研究進(jìn)一步展示了基于SISBAR技術(shù)的新發(fā)現在改進(jìn)帕金森癥細胞治療策略中的應用。SISBAR技術(shù)有望為干細胞研究帶來(lái)新的突破。
發(fā)育與干細胞生物學(xué)中的一個(gè)基礎性問(wèn)題是如何解析生物體內不同細胞類(lèi)型之間的發(fā)育譜系關(guān)系。解析這些譜系關(guān)系能夠更加深入地解析生命體的正常發(fā)育過(guò)程以及病理狀態(tài)（包括癌癥與發(fā)育障礙）下的分子機制，為操縱在體細胞分化命運，優(yōu)化體外細胞分化方法，以及促進(jìn)基于細胞替代療法的再生醫學(xué)的發(fā)展提供線(xiàn)索。然而，經(jīng)典的正向譜系追蹤和逆向譜系追蹤方法，主要用于解析同一個(gè)分化/發(fā)育時(shí)間點(diǎn)不同細胞類(lèi)型之間的譜系關(guān)系，而不能同時(shí)提供在上一個(gè)階段與它們有親緣關(guān)系的前體細胞的身份特征。如何持續地追蹤細胞在多個(gè)分化/發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的細胞狀態(tài)，從而描繪更完整的細胞發(fā)育路徑，是發(fā)育學(xué)領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題。
針對以上問(wèn)題，團隊成員通過(guò)結合病毒介導的細胞條形碼標記技術(shù)、單細胞測序技術(shù)，以及克隆分離策略，開(kāi)發(fā)了SISBAR技術(shù)，并應用在基于人多能干細胞的神經(jīng)分化模型中。SISBAR技術(shù)可以跨分化階段追蹤單個(gè)前體細胞衍生的譜系克隆，同時(shí)獲取該前體細胞的單細胞轉錄組信息（圖A）。研究團隊一直致力于人多能干細胞神經(jīng)分化技術(shù)的開(kāi)發(fā)和神經(jīng)系統疾病的細胞治療研究，建立了將人多能干細胞分化為人腹側中腦和后腦細胞的方法，其中包含能夠用于帕金森癥細胞替代療法的關(guān)鍵細胞類(lèi)型–中腦多巴胺能神經(jīng)元（2016 Cell Stem Cell; 2021 Cell Stem Cell; 2022 JCI）。
團隊成員把SISBAR技術(shù)應用于人腹側中后腦的體外分化體系，并建立了“潛能視角”和“起源視角”的譜系分析方法來(lái)分別解析由轉錄組定義的不同細胞類(lèi)型的分化潛能及分化起源，從而構建了一個(gè)多層級的譜系樹(shù)來(lái)描繪整個(gè)分化過(guò)程（圖B）。這一多層級譜系樹(shù)揭示了中后腦細胞分化過(guò)程中許多之前未被報道過(guò)的發(fā)散型和匯聚型跨階段譜系分化路徑。團隊的研究還揭示了跨分化階段的群體水平譜系和克隆水平譜系之間的關(guān)系：在發(fā)散型譜系關(guān)系中，發(fā)現同種類(lèi)型的前體細胞（單細胞轉錄組定義的細胞簇）中單個(gè)前體細胞的命運可以不同；不同前體細胞差異的分化命運的集合代表了該前體細胞類(lèi)型在群體水平的分化命運。在匯聚型譜系關(guān)系中，發(fā)現同種類(lèi)型子代細胞中的單個(gè)細胞可以有不同的譜系起源，并且這些不同來(lái)源的子代細胞會(huì )帶有其親代細胞獨特的基因印跡（圖C-D）。
研究團隊進(jìn)一步展示了基于SISBAR技術(shù)的跨分化階段譜系關(guān)系和相關(guān)分子調控機制的解析在神經(jīng)系統疾病細胞治療中的應用。利用SISBAR技術(shù)，研究團隊發(fā)現中腦多巴胺能神經(jīng)前體細胞具有至少三種命運分化潛能，包括中腦多巴胺能神經(jīng)元、中腦谷氨酸能神經(jīng)元、血管軟腦膜樣細胞（VLMCs）。研究團隊還鑒定了早期中腦多巴胺能神經(jīng)前體細胞的特異性表面分子標記物APCDD1（圖E）。將表達APCDD1的神經(jīng)前體細胞進(jìn)行流式分選并移植到帕金森病模型小鼠的紋狀體后，移植物中目的細胞-中腦多巴胺能神經(jīng)元的比例得到了顯著(zhù)提高（圖F）。并且，與通過(guò)SISBAR技術(shù)發(fā)現的中腦多巴胺能神經(jīng)前體細胞多分化潛能的結果一致。研究團隊在APCDD1分選的移植物中檢測到了中腦谷氨酸能神經(jīng)元和一種血管軟腦膜樣細胞的存在，這一結果展示了SISBAR技術(shù)在改進(jìn)細胞治療策略和預測移植細胞體內分化命運中的應用。
基于人多能干細胞的細胞替代療法在治療許多用傳統藥物難以治愈的疾?。ㄈ缗两鹕Y）方面具有廣闊的應用前景。然而，人多能干細胞分化得到的供體細胞（細胞藥物）存在顯著(zhù)的異質(zhì)性，這將導致供體細胞和移植物中目的細胞的低比例和細胞組成的不穩定性，阻礙了細胞替代療法在臨床上更廣泛地應用?？梢灶A見(jiàn)的是，作為一種通用型技術(shù)，SISBAR能夠廣泛地應用于包括神經(jīng)分化在內的基于人多能干細胞的體外分化系統中，構建整個(gè)分化過(guò)程的譜系發(fā)育樹(shù)，解析譜系分化的分子調控機制，使我們更好地理解目的細胞和非目的細胞在分化過(guò)程中產(chǎn)生的機制，從而改進(jìn)細胞治療策略，獲得更安全穩定的細胞治療結果。同時(shí)，SISBAR還為我們解析細胞分化/發(fā)育過(guò)程中的譜系關(guān)系提供了新的方法和視角，是經(jīng)典譜系追蹤方法的重要補充。本研究中群體水平譜系和克隆水平譜系關(guān)系的解析，為我們理解細胞分化分過(guò)程中復雜而精確的細胞命運決定事件提供了重要的理論基礎。
該研究由中科院腦智卓越中心博士研究生游致文與中科院營(yíng)養健康所王露悅博士，在腦智卓越中心陳躍軍研究員和臨港實(shí)驗室魏武研究員的指導下完成，中科院腦智卓越中心何慧博士、吳子彥博士、章馨月、薛帥翔、許培博博士，職工張曉、劉兵，中科院營(yíng)養與健康所洪延泓，復旦大學(xué)腦科學(xué)研究院熊曼研究員，復旦大學(xué)附屬腫瘤醫院胡欣研究員為本研究提供了重要幫助。本研究得到了中科院、科技部、基金委和上海市科委的資助。
圖注：（A）用于跨時(shí)間點(diǎn)克隆譜系追蹤的SISBAR實(shí)驗設計示意圖。（B）跨越四個(gè)分化階段多層級譜系樹(shù)，展示了不同分化時(shí)間段不同細胞類(lèi)型之間顯著(zhù)的遺傳譜系關(guān)系。（C-D）兩種不同的匯聚型譜系分化路徑示意圖。（E）特異性表達在中腦多巴胺能神經(jīng)元早期前體細胞中的基因。（F）未分選的神經(jīng)前體細胞和APCDD1+神經(jīng)前體細胞衍生的移植物典型圖和移植物中TH+神經(jīng)元的比例，hN，人源細胞核。比例尺，大圖中為100 μm，小圖中為20 μm。
附件下載： 
